Danas razgovarajmo o ključnom elementu u PCR eksperimentima – potrošnom materijalu. Kao čest posjetitelj PCR-a, potrebno je razumjeti karakteristike i terminologiju vezanu uz PCR potrošni materijal.
Na tržištu postoji veliki izbor PCR potrošnog materijala, uključujući marke, specifikacije, boje itd., koji su blistavi. Shvatimo to korak po korak.
pcr ploča
1. Materijali
Obično je sirovina PCR potrošnog materijala polipropilen. To je dobar inertni materijal otporan na toplinu. Raspon radne temperature je od -30 do 140 stupnjeva, što mu omogućuje da izdrži promjene toplinske energije tijekom toplinskog ciklusa PCR reakcije i igra dobru ulogu u brtvljenju i zaštiti tvari u sustavu PCR reakcije.
Saznajte više o polipropilenu
2. Boja
Uobičajene su bijele epruvete i prozirne PCR epruvete. U tradicionalnim PCR eksperimentima nema razlike između to dvoje. Međutim, u istom eksperimentu u stvarnom vremenu/qPCR-u, bijele epruvete bile su relativno osjetljivije i dosljednije za qPCR instrumente s apikalnim očitavanjem signala (vidi slike A i B u nastavku). zašto je ovako
pcr cijev
A: niže vrijednosti Ct za bijele cijevi u usporedbi s prozirnim cijevima; B: bolja ponovljivost s bijelim cijevima.
Osnovni podatak qPCR-a je Ct vrijednost, a fluorescencijski signal je izvor podataka za izračun Ct vrijednosti, stoga je vrlo važno može li se fluorescencija u cijevi u potpunosti prenijeti na detektor. Bijela stijenka cijevi sprječava prolazak fluorescencije kroz stijenku cijevi i lomljenje (slika A dolje), čime se sprječava prijenos fluorescencije na grijaći blok (tj. stijenku metalne rupe u koju je postavljena cijev) i apsorpciju ili nedosljedno odražava blok. Jači i koncentriraniji fluorescentni signal prikupljen je na vrhu bijele cijevi u usporedbi s prozirnom cijevi (slika B dolje).
pcr cijev
O: Trend promjene fluorescentnog signala u prozirnoj i bijeloj cijevi; B: Usporedba intenziteta fluorescencije nakon dodavanja iste količine fluoresceina.
Dakle, ako koristite qPCR instrument s najboljim očitanjem, isprobajte bijele cijevi.
3. Kvaliteta (lean ili nelean)
Ovdje je naglašena važnost kvalitete potrošnog materijala. Potrošni materijal za qPCR ne smije sadržavati kontaminante i inhibitore. Visoki tlak i zračenje uklanjaju bakterije i DNAze, ali ne i prašinu i ostatke DNA, koji mogu inhibirati PCR reakcije ili proizvesti nespecifično pojačanje. Tvari imaju apsorpciju, pa će čak i sićušni zagađivači apsorbirati fluorescenciju u reakcijskom sustavu i utjecati na prikupljanje fluorescentnih signala. Pretjerana verzija eksperimenta korištena je da se pokaže učinak onečišćenja nečistoćama na eksperiment. Kao što je prikazano na donjoj slici, nečistoća je stavljena u jednu od reakcijskih jažica oktave. Kao što se očekivalo, krivulje pojačanja pokazale su izražene anomalije.
Nečistoće u PCR reakcijskim epruvetama
↑ Nečistoće u reakcijskoj cijevi
8 traka
↑ Rezultati ponovljene reakcije za 8 epruveta, nečistoća u lijevoj jažici "odstupa" od krivulje.
Podsjetnik: Pazite da ne izlažete potrošni materijal zraku duže vrijeme. Nakon što izvadite potrošni materijal, obavezno brzo zatvorite vrećicu za pakiranje kako je ne biste dodirivali golim rukama. Ako je moguće, radite na čistoj klupi.
4. Kapacitet / veličina / tok
Volumen određuje koliko se uzorka (reakcijski volumen) može napuniti. Predoziranje može dovesti do smanjene učinkovitosti prijenosa topline, prolijevanja ili unakrsne kontaminacije; premalo doziranje može dovesti do gubitka uzorka isparavanjem. Grijaći blok instrumenta qPCR također će odrediti primjenjive potrošne materijale i primjenjivu veličinu reakcijskog sustava. Protok je lako razumjeti, to je najveći broj uzoraka koji se mogu učitati u jednom eksperimentu. Uobičajeni kapacitet i specifikacije protoka prikazani su u tablici ispod:
Jedna epruveta/osam redova {{0}}.2mL, 0,1mL
{{0}}pločica s jažicom 0.2mL, 0,1mL
{{0}}jažična ploča 0,2 ml
Specifikacije kapaciteta također se općenito dijele na standardne i niske tipove, kao što je prikazano u nastavku. Potrošni materijal niskog profila ima nižu visinu. Ova kratka konstrukcija minimalizira prostor iznad reakcijskog sustava ("mrtvi volumen" - beskorisni dio), smanjuje učinke isparavanja tijekom toplinskog ciklusa i omogućuje modulu grijanja da se omota oko njega u većoj mjeri kako bi se poboljšala učinkovitost prijenosa topline. Stoga su cijevi niskog profila poznate i kao "brze" cijevi ili ploče.
pcr cijev
Podsjetnik: uobičajeno korišteni reakcijski volumen je 20 µL, a preporuča se koristiti reakcijsku epruvetu malog volumena od 0,1 mL ili malog volumena.
5. Debljina stijenke
Debljina stijenke cijevi izravno utječe na toplinsku vodljivost. Potrošni materijal za PCR treba imati jednaku debljinu stjenke kako bi se osigurao dosljedan prijenos topline. Ultratanka stijenka cijevi je 50 posto tanja od standardne verzije, što dodatno smanjuje toplinsku barijeru i donosi brže i bolje učinke odziva. Stoga, kako bi se maksimizirala učinkovitost PCR reakcija i osigurale stabilne i učinkovite reakcije, uniformni i ultratanki PCR potrošni materijal najbolji su izbor.
6. Transparentnost
Poklopci i filmovi za brtvljenje za qPCR zahtijevaju visoku optičku jasnoću kako bi se osiguralo optimalno prodiranje i prijenos fluorescentnih signala uz smanjenje izobličenja (za qPCR instrumente s gornjim očitavanjem). Što je veća prozirnost stijenke cijevi, to može utjecati na eksperimentalne rezultate. Razlog je gore objašnjen. Tradicionalni PCR može zanemariti ovu značajku.
7. Suknje
Rub PCR ploče odnosi se na periferni nastavak ploče. Prilikom izgradnje reakcijskih sustava, obloga djeluje kao stabilna potpora za procese pipetiranja i osigurava mehaničku čvrstoću i prianjanje u kombinaciji s automatiziranim radnim stanicama. Postoje tri uobičajene vrste suknji, polusuknje i pune suknje (koje odgovaraju A, B i C na donjoj slici).
Skirtless: Može se koristiti s većinom PCR ili qPCR instrumenata, ali ne i za automatizirane primjene. Lako se pomiče tijekom pipetiranja, nije baš stabilan, potrebno ga je koristiti s držačem za ploču.
Polusuknje: Idealne za automatizirane primjene s dobrom stabilnošću pipetiranja.
Puna podna ploča: Idealna za automatizirane primjene. Dobra mehanička čvrstoća, pogodna za PCR instrumente s izbočenim modulima, visoka stabilnost tijekom pipetiranja.
pcr ploča
Savjeti: Značaj suknje je više u olakšavanju industrijalizacije i automatizirane serijske obrade, u kombinaciji s robotskom rukom. Možda neće biti potrebna u tradicionalnim istraživačkim laboratorijima, nijedna suknja nije dovoljna.
pcr ploča
8. Parafilm
Film za brtvljenje PCR ploče izrađen je od prozirne plastike ili aluminijske folije. Ljepljivi prozirni filmovi su češći, prikladni za ploče s 96 ili 384 jažice i trebaju imati dovoljno dobru propusnost svjetla. Prilikom brtvljenja folije, koristit će se mala kartica za pritiskanje folije oko otvora za brtvljenje kako bi se izbjeglo curenje zraka.
Ljepljive aluminijske folije mogu biti rjeđe. Iako nije prikladan za qPCR, idealan je potrošni materijal za uzorke osjetljive na svjetlo. Budući da se može bušiti, olakšava prijenos uzorka u PCR (za konvencionalni PCR).
Film za brtvljenje PCR ploče
Rezimirati
Kao nositelj PCR sustava, potrošni materijal je vrlo važan za poboljšanje kvalitete eksperimentalnih podataka. Nadam se da vam ovo dijeljenje može pomoći u razumijevanju nekih savjeta o PCR potrošnom materijalu i pružiti pomoć za bolji odabir potrošnog materijala.
