Kad ste tek diplomirali i ušli u posao, suočeni ste s hrpom imenica koje se suočavaju s kvantitativnim PCR eksperimentima u stvarnom vremenu. Jeste li zbunjeni gdje početi? Koje je značenje krivulje pojačanja, standardne krivulje, praga, CT vrijednosti, krivulje topljenja i osnovne linije? Fluorescentne slike iz tih eksperimenata su presvijetle, ali čini se da ih ne mogu identificirati. Danas ćemo vas povesti da naučite ova znanja i koncepte u dva dijela: tehnički izrazi i često postavljana pitanja.
Dio I Profesionalni uvjeti
1. Krivulja pojačanja
Krivulja amplifikacije odnosi se na krivulju gdje je broj ciklusa apscisa, a intenzitet fluorescencije u stvarnom vremenu tijekom reakcije ordinata tijekom PCR-a.
2. Polazna linija
Osnovna vrijednost odnosi se na malu promjenu fluorescentnog signala tijekom prvih nekoliko ciklusa PCR reakcije pojačanja. Razina signala pokazuje se blizu ravne linije, što je osnovna linija.
3. Postavka praga fluorescencije
Obično se signal fluorescencije prvih 15 ciklusa PCR reakcije koristi kao pozadinski signal fluorescencije, a prag fluorescencije je 10 puta veći od standardne devijacije signala fluorescencije tijekom 3-15 ciklusa PCR, a prag fluorescencije postavlja se tijekom eksponencijalne faze PCR amplifikacije. Tipično, svaki instrument ima svoj prag fluorescencije prije upotrebe.
4. CT vrijednost
CT vrijednost predstavlja broj ciklusa koji će se dogoditi za svaku PCR reakcijsku epruvetu kada fluorescentni signal dosegne postavljeni prag. Iz istraživanja znamo da postoji linearni odnos između CT vrijednosti svakog predloška i logaritma početnog broja kopije tog predloška. Što je veći početni broj kopija, manja je CT vrijednost i obrnuto. Koristeći standarde s poznatim početnim brojem kopija, može se napraviti kalibracijska krivulja gdje apscisa predstavlja logaritam početnog broja kopija, dok ordinata predstavlja CT vrijednost. Stoga, sve dok se dobije CT vrijednost nepoznatog uzorka, početni broj kopija uzorka može se izračunati iz standardne krivulje.
znati više
Postoji nekoliko pokazatelja za procjenu je li krivulja pojačanja dobra ili ne:
Odgovor: Točka infleksije krivulje je očita, posebno je očita eksponencijalna faza uzorka niske teške frakcije, ukupni paralelizam krivulje pojačanja je vrlo dobar, osnovna linija je ravna, nema fenomena porasta, a pojačanje krivulja uzorka koncentracije eksponencijalne faze niske razine je vrlo dobra. očito.
B: Nagib eksponencijalne faze krivulje izravno je proporcionalan učinkovitosti pojačanja, što je veći nagib, veća je učinkovitost pojačanja.
C: Standardna osnovna linija je ravna ili blago pada, bez vidljivog uzlaznog trenda.
D: Paralelnost krivulja pojačanja za svaku epruvetu je dobra, što ukazuje da je učinkovitost pojačanja svake reakcijske epruvete slična.
5. Krivulja taljenja
Kada se PCR produkt zagrijava, kako temperatura raste, dvolančani produkt pojačanja postupno se disocira, što rezultira smanjenjem intenziteta fluorescencije. Kada se postigne određena temperatura, velika količina produkta se odvoji, što rezultira naglim smanjenjem fluorescencije. Korištenje ove funkcije zajedno s različitim vrijednostima TM za različite PCR proizvode također se razlikuje u temperaturi na kojoj se fluorescentni signal brzo smanjuje, što može biti dobar način za identifikaciju specifičnosti PCR.
6. Krivulja taljenja (upotrebom logaritamske krivulje)
Grafikon vršne vrijednosti formira se logaritmom krivulje taljenja kako bi se intuitivnije prikazala situacija fragmenata proizvoda. Budući da je temperatura taljenja TM vrijednost fragmenta DNA, mogu se odrediti određeni parametri koji utječu na vrijednost TM fragmenta DNA, kao što je veličina fragmenta, sadržaj GC, itd. Općenito, prema našem načelu dizajna primera, obično se kaže da je duljina pojačanog produkta u rasponu od 80-300bp, a temperatura taljenja treba biti između 80 stupnjeva i 90 stupnjeva.
O: Ako postoji samo jedan glavni vrh između 80 stupnjeva i 90 stupnjeva, to znači da je PCR u stvarnom vremenu savršen.
B: Ako se glavni vrh pojavljuje između 80 stupnjeva i 90 stupnjeva, a vrh nečistoće se pojavljuje ispod 80 stupnjeva, u osnovi se uzima u obzir primer-dimer. Ovo je dobra opcija za pokušati riješiti podizanjem temperature žarenja.
C: Ako se glavni vrh pojavljuje između 80 stupnjeva i 90 stupnjeva, a lutajući vrh se pojavljuje kada se temperatura poveća, u osnovi se razmatra kontaminacija DNK. A DNK treba ukloniti u početnim fazama eksperimenta.
7. Standardna linija krivulje
Standardni standardi su razrijeđeni do različitih koncentracija i korišteni kao predlošci za PCR reakcije. Standardna krivulja je iscrtana s logaritmom standardnog broja kopija kao apscisom i izmjerenom CT vrijednošću kao ordinatom. Pri kvantificiranju nepoznatog uzorka, broj kopija uzorka može se dobiti iz standardne krivulje na temelju CT vrijednosti nepoznatog uzorka. Standardne krivulje vrlo su važne za apsolutnu kvantifikaciju.
drugi dio. čest problem
P1: Koja je razlika između RT-PCR-a, QPCR-a, PCR-a u stvarnom vremenu i RT-PCR-a u stvarnom vremenu?
A1: RT-PCR je PCR obrnute transkripcije, koja je široko korištena varijanta lančane reakcije polimerazom. U RT-PCR, RNA lanac se reverzno transkribira u komplementarnu DNA, koja se zatim koristi kao predložak za PCR za umnožavanje DNA pomoću PCR-a.
Real-time PCR i QPCR su ista stvar, oba su kvantitativni PCR u stvarnom vremenu, što znači da postoji snimanje podataka u stvarnom vremenu u svakom ciklusu tijekom PCR procesa. Na taj način se može precizno analizirati broj predložaka za pokretanje.
Iako se čini da se i PCR u stvarnom vremenu i PCR s obrnutom transkripcijom nazivaju skraćenicom RT-PCR, međunarodna je konvencija da se RT-PCR odnosi posebno na PCR s obrnutom transkripcijom, dok se PCR u stvarnom vremenu često označava skraćenicom kao qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR ) - vremenski PCR).
RT-PCR u stvarnom vremenu (RT-QPCR) je vrsta PCR-a s obrnutom transkripcijom koja kombinira fluorescentne kvantitativne tehnike: prva reverzna transkripcija iz RNA da se dobije cDNA (RT), nakon čega slijedi kvantitativna analiza pomoću PCR-a u stvarnom vremenu (QPCR).
P2: Zašto je duljina umnoženog fragmenta produkta fluorescentnog kvantitativnog PCR-a kontrolirana unutar raspona od 80-300bp?
A2: Duljina svake genske sekvence je različita, neki od njih su nekoliko Kb i stotine BP. Međutim, kada dizajniramo početnicu, trebamo samo zahtijevati da duljina produkta bude 80-300bp, a prekratak ili predug nije prikladan za kvantitativnu PCR detekciju.
Fragmenti proizvoda su prekratki da bi se razlikovali od početnih dimera. Duljina primer-dimera je oko 30-40bp, a kada je manja od 80 bp, teško je razlučiti radi li se o primer-dimeru ili proizvodu. Ako je fragment produkta predugačak, veći od 300 bp, to će lako dovesti do niske učinkovitosti pojačanja, a količina gena ne može se učinkovito otkriti.
Na primjer, kada brojite broj ljudi u učionici, trebate samo izbrojati koliko ima usta. Isto vrijedi i za testiranje gena. Trebate samo otkriti određenu sekvencu gena da biste predstavili cijelu sekvencu. Lako je pogriješiti ako brojite i usta i nos, uši i naočale da biste brojali ljude.
P3: Koja je optimalna duljina za dizajn temeljnog premaza?
A3: Općenito govoreći, duljine primera u rasponu od 20-24bp su dobre. Naravno, pri projektiranju temeljnog premaza moramo obratiti pozornost na TM vrijednost temeljnog premaza, jer je on povezan s optimalnom temperaturom žarenja. Nakon mnogo eksperimenata, dokazano je da je 60 stupnjeva dobra TM vrijednost. Niska temperatura žarenja može lako dovesti do nespecifičnog pojačanja, dok visoka temperatura žarenja obično dovodi do niske učinkovitosti pojačanja, kasnog vrha krivulje pojačanja i odgođene CT vrijednosti.
Pitanje 4: Utječe li količina prikupljenog uzorka na eksperimentalne rezultate?
O4: Ne. Očito, što je više uzoraka prikupljeno, što je više ekstrahirane RNA, to će biti više cDNA i više ciljnih fragmenata. Za apsolutnu kvantifikaciju potrebno je izračunati broj kopija ciljnog fragmenta, a količina prikupljenog uzorka će svakako utjecati na eksperimentalne rezultate. Na primjer, otkrivanje HBV virusa hepatitisa C u krvi je otkrivanje sadržaja HBV u određenoj količini (1 ml) krvi.
Za relativnu kvantifikaciju koja se obično koristi u znanstvenim istraživanjima, broj uzoraka nema nikakve veze s eksperimentalnim rezultatima, jer se relativna kvantifikacija odnosi na usporedbu između ciljnog i referentnog gena. Molimo vas da ih samo smatrate uzvodnim i nizvodnim fragmentima prisutnima u istom lancu nukleinske kiseline. Ako je veličina uzorka velika, i referentni i ciljni geni povećavaju se u jednakom omjeru u isto vrijeme, što ne utječe na rezultate.
P5: Hoće li učinkovitost reverzne transkriptaze utjecati na eksperimentalne rezultate?
A5: Isto kao gore. Imajte na umu da želimo veću učinkovitost RT, ali preferiramo da enzim RT bude relativno stabilan i da dobije ujednačene rezultate. Ovo će biti test optimiziranih mogućnosti paketa za obrnutu transkripciju velikih tvrtki.
Pitanje 6: Utječe li učinkovitost enzima TAQ na eksperimentalne rezultate?
A6: Učinkovitost TAQ enzima je relativno velika. Obično su potrebni taq enzimi s vrućim startom i relativno su učinkoviti. Za komercijalne kvantitativne komplete fluorescencije, svaki će proizvođač optimizirati učinkovitost najboljeg stanja prema vlastitim proizvodima blizu 100 posto, ako je učinkovitost preniska, eksperimentalni rezultati se ne mogu dobiti. Za proizvode različitih tvrtki ovo je mjera kvalitete.
Pitanje 7: Utječe li količina fluorescentne boje na eksperimentalne rezultate?
A7: Da, hoće. Ako je fluorokrom previše zasićen, može uzrokovati smetnje u radu nekih instrumenata. Ako fluorokrom nije zasićen, a vrijednost fluorescencije je preniska, rano će ući u fazu platoa i krivulja pojačanja će biti ravna. U kvantitativnom eksperimentu fluorescencije uglavnom se vidi CT vrijednost, tako da nije važno da krivulja kasne amplifikacije uđe u stadij platoa, ali slika nije dovoljno lijepa. Ako ste morali birati, počnite odabirom fluorokroma koji je nešto manje zasićen. Međutim, kada se koristi isti proizvod iste tvrtke, njegov učinak je u osnovi zanemariv.
Pitanje 8: Hoće li prijenos PCR epruvete utjecati na eksperimentalne rezultate?
A8: Da. Međutim, za istu seriju potrošnog materijala istog proizvođača ovaj se učinak može zanemariti. Ovo je dobar izbor i najbolje je koristiti 96-ploču s jažicama s membranom visoke propusnosti kako bi se smanjio učinak propusnosti svjetla potrošnog materijala.
P9: Hoće li pogreške tijekom rada utjecati na eksperimentalne rezultate?
A9: Utjecaj procesa rada uglavnom se ogleda u ujednačenosti. Homogenost znači da su sve komponente u sustavu ravnomjerno pomiješane, a flash centrifugiranje može riješiti ovaj problem. Osim toga, za početnike je najbolje prilagoditi PCR sustav na više od 20 inča, a premali sustav skloniji je greškama. Ako je temperatura žarenja pravilno optimizirana, učinak koncentracije primera na CT je sveden na minimum. I znat ćete da se neke greške u radu (kao što je koncentracija temeljnog premaza) mogu izbjeći optimiziranjem temperature žarenja.
Rezimirati
Gore su navedena neka pitanja i pitanja s kojima se početnici često susreću tijekom eksperimenta, nadamo se da vam ova pitanja mogu pomoći u rješavanju nekih zabuna. Eksperimentiranje je proces stvaranja kaosa i rješavanja problema, nadamo se da ćete time nešto izvući. Hvala na čitanju i vidimo se sljedeći put!