Princip PCR-a je korištenje DNA koja denaturira i postaje jednolančana na visokoj temperaturi od 95°C in vitro. Na niskim temperaturama (obično oko 60°C), početnici i jednolančani se kombiniraju prema principu komplementarnog uparivanja baza, a zatim se temperatura podešava na DNA polimerazu. Na optimalnoj reakcijskoj temperaturi (oko 72°C), DNA polimeraza sintetizira komplementarne niti duž smjera fosforne kiseline do pet ugljikovih šećera (5'-3').
Najvrednije područje primjene PCR-a je dijagnostika zaraznih bolesti. U teoriji, sve dok postoji patogen u uzorku, PCR se može otkriti.
U pokusima je utvrđeno da se DNK može denaturirati i otopiti na visokim temperaturama, a pri snižavanju temperature može se ponovno renaturirati u dvostruke niti. Stoga, kontroliranjem denaturacije i renaturacije DNA promjenama temperature, dodavanjem početnih uzoraka, DNA polimeraze i dNTP-a može se dovršiti in vitro replikacija specifičnih gena.
Međutim, DNA polimeraza će biti inaktivirana na visokim temperaturama. Stoga se u svakom ciklusu mora dodavati nova DNA polimeraza, što je ne samo glomazno za rad, već i skupo, što ograničava primjenu i razvoj PCR tehnologije.