PCR tehnologija mora imati umjetno sintetizirane razumne primere i ekstrahiranu DNK uzorka, a zatim izvršiti automatsko termalno cikliranje i na kraju izvršiti identifikaciju i analizu proizvoda. Trenutačno se dizajn i sinteza temeljnog premaza mogu izvesti samo u nekoliko istraživačkih instituta, instituta i klinika s jakom tehničkom snagom. Aplikacija treba samo kupiti komplet za detekciju PCR-a kako bi započela rad. Postoji mnogo čimbenika koji utječu na PCR automatski termalni ciklus. Za različite uzorke DNA, količina različitih komponenti dodanih u PCR reakciji i parametri temperaturnog ciklusa su nedosljedni.
Sada je predstavljeno nekoliko glavnih čimbenika koji utječu.
Jedan, parametri temperaturnog ciklusa
U PCR automatskom termičkom ciklusu, najkritičniji faktor je temperatura denaturacije i žarenja. Kao što je prikazano u primjeru operacije, uvjeti denaturacije, žarenja i ekstenzije su: 94℃60s, 37℃60s, 72℃120s, ukupno 25～30 A ciklus, pojačani fragment je 500bp. Ovdje treba izračunati vrijeme svakog koraka nakon što reakcijska smjesa postigne potrebnu temperaturu. U automatskom termičkom ciklusu, vrijeme od početne temperature smjese do tražene temperature traje 30-60s. Duljina ovog vremena kašnjenja ovisi o nekoliko čimbenika, uključujući vrstu reakcijske cijevi, debljinu stijenke, volumen reakcijske smjese, toplinu izvor (vodena kupelj ili grijaći blok), te temperaturnu razliku između dva koraka, koju treba na odgovarajući način osigurati pri postavljanju toplinskog ciklusa. Obratite pažnju i razmotrite, a stvarno mjerenje treba provesti na svakom instrumentu.
Još jedno važno razmatranje o vremenu toplinskog ciklusa je udaljenost između dva temeljna premaza; što je udaljenost veća, to je duže potrebno da se sintetizira puna duljina ciljne sekvence. Gore navedeno vrijeme reakcije temelji se na optimalnoj duljini sinteze od 500 bp. Ciljna sekvenca je sastavljena. Ovdje je uvod u odabir različitih temperatura.
1. Temperatura denaturacije predloška Temperatura denaturacije određuje temperaturu na kojoj se dvolančana DNA topi u PCR reakciji. Ako se ne postigne temperatura denaturacije, neće se proizvoditi jednolančani DNK šablon i PCR neće započeti. Niska temperatura denaturacije znači nepotpunu denaturaciju, DNK dvolančanu. Brzo će se renaturirati, čime se smanjuje prinos. Općenito 90～95 ℃. Nakon što uzorak dosegne ovu temperaturu, treba ga brzo ohladiti na temperaturu žarenja. Denaturacija DNK traje samo nekoliko sekundi, a nije potrebna dugo; naprotiv, trebali biste se potruditi na visokoj temperaturi. Skratite ga kako biste zadržali aktivnost Taq DNA polimeraze. Maksimalna temperatura denaturacije nakon dodavanja Taq DNA polimeraze ne smije prelaziti 95°C.
2. Temperatura žarenja temeljnog premaza Temperatura žarenja određuje specifičnost i prinos PCR-a; ako je temperatura visoka, specifičnost je jaka, ali ako je temperatura previsoka, primer se ne može čvrsto spojiti s šablonom, a učinkovitost amplifikacije DNA je smanjena; temperatura je niska, prinos je visok, ali prenizak može uzrokovati neusklađenost primera i predloška , Nespecifični proizvodi se povećavaju. Općenito, započnite s reakcijskim uvjetom od 37 ℃, postavite niz kontrolnih reakcija kako biste odredili optimalnu temperaturu žarenja za određenu reakciju. Također se može zaključiti na temelju (G+}C)% sadržaja temeljnih premaza kako bi se shvatio test Polazna točka općeg testa, temperatura žarenja Ta (temperatura žarenja) je 5 ℃ niža od temperature taljenja TTm (temperatura taljenja) amplifikacijskog primera, koji se može izračunati prema formuli:
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Među njima, A, T, G, odnosno C predstavljaju broj odgovarajućih baza. Na primjer, za temeljni premaz od 20 baza, ako je sadržaj (G+C)% 50%, početna točka Ta može se postaviti na 55°C. Pri tipičnoj koncentraciji temeljnog premaza (kao što je 0,2 μmol/L), reakcija žarenja može se završiti za nekoliko sekundi, a dugotrajno žarenje nije potrebno.
3. Izbor temperature ekstenzije primera ovisi o optimalnoj temperaturi Taq DNA polimeraze. Općenito 70～75℃, standardna brzina nukleotida kataliziranih enzima na 72℃ može doseći 35～100 nukleotida/sek. po minuti. Duljina od 1kb može se produžiti, a njezina brzina ovisi o sastavu puferske otopine, pH vrijednosti, koncentraciji soli i prirodi DNK šablona. Ako je amplificirani fragment kraći od 150 bp, korak ekstenzije se može izostaviti i on postaje dvostruki temperaturni ciklus, zbog Taq DNA. Polimeraza je dovoljna da dovrši sintezu kratkih sekvenci na temperaturi žarenja. Za fragmente kratkih sekvenci između 100 i 300 bp, učinkovito je koristiti brz i jednostavan ciklus s dvostrukom temperaturom. U ovom trenutku, temperatura produžetka temeljnog premaza je ista kao i temperatura žarenja. Za fragmente DNA veće od 1 kb, vrijeme produljenja može se kontrolirati unutar 1 do 7 minuta ovisno o duljini fragmenta. Istodobno, u PCR pufer treba dodati želatinu ili BSA reagens kako bi Taq DNA polimeraza bila aktivna i stabilna dulje vrijeme. Seks; 15%-20% glicerola pomaže u amplifikaciji oko 2,5kb ili dužih fragmenata DNA.
4. Broj ciklusa konvencionalnog PCR-a je općenito 25 do 40 ciklusa. Opća pogreška je da je broj ciklusa prevelik, nespecifična pozadina je ozbiljna, a složenost se povećava. Naravno, broj ciklusa reakcije je premali, a prinos je nizak. Stoga je potrebno osigurati da se proizvod dobije. Pod pretpostavkom stope, broj ciklusa treba biti minimiziran.
Nakon što je amplifikacija završena, uzorak se ohladi i pohrani na 4°C.
2. Dizajn temeljnog premaza
Da biste pojačali DNK šablone, prvo morate dizajnirati dva oligonukleotidna prajmera. Takozvani primeri su zapravo dva oligonukleotidna fragmenta koji su komplementarni ciljnoj DNA sekvenci koju treba pojačati. Udaljenost između dva primera određuje duljinu amplificiranog fragmenta. , 5'krajevi dvaju početnica određuju položaje dvaju 5'kraja pojačanog proizvoda. Vidi se da su primeri ključ za određivanje duljine, položaja i rezultata PCR amplificiranih fragmenata, a dizajn primera je važniji.
Neophodan uvjet za dizajn primera je da ciljna DNA sekvenca komplementarna prajmeru mora biti poznata. Slijed između dva početnica nije nužno jasan. Dvije poznate sekvence su općenito 15-20 baza, koje se mogu sintetizirati pomoću DNA sintetizatora. Odgovarajući na dva komplementarna temeljna premaza, osim toga, načela koja se općenito slijede u dizajnu temeljnog premaza uključuju:
1. Duljina prajmera izračunava se prema statistici, a vjerojatnost da se oligonukleotidni slijed od oko 17 baza može pojaviti u ljudskom genomu je jednom. Stoga duljina prajmera općenito nije manja od 16 nukleotida, a najveća ne više od 30 nukleotida, a najbolja duljina je 20-24 nukleotida. Takvi kratki oligonukleotidi neće formirati stabilan hibrid na temperaturi polimerizacije (prelaskom 72°C). Ponekad može biti na 5' Dodajte sekvence koje nisu komplementarne predlošku na kraju, kao što su mjesta restrikcijskih enzima ili promotori, da biste dovršili kloniranje gena i druge posebne potrebe; temeljna biotinska oznaka 5'krajnja ili fluorescentna oznaka može se koristiti u različite svrhe kao što je detekcija mikroba.
Ponekad temeljni premaz'ne radi, razlog je nepoznat, možete pomaknuti poziciju da to riješite.
2. Sastav temeljnih premaza (G+C)% sadržaja trebao bi biti ujednačen i pokušajte izbjeći da sadrže isti osnovni polimer. Sadržaj (G+C)% u dva primera trebao bi biti što sličniji, u poznatom pojačanom fragmentu (G+C) % Sadržaj trebao bi biti blizak fragmentu koji se amplificira, općenito 40% do 60% je bolje.
3. Unutarnji dio temeljnog premaza treba izbjegavati stvaranje očitih sekundarnih struktura, posebno struktura ukosnica. Na primjer:
4. Ne bi trebalo biti nadopunjavanja između dva primera između temeljnih premaza, posebno na 3'kraju primera. Čak i ako se to ne može izbjeći, komplementarna baza 3'kraja ne smije biti veća od 2 baze, inače je lako formirati"primer dimer" Ili"Primer dimer" (Primer dimer). Takozvani dimer primera je u biti dvolančani DNA fragment nastao produžavanjem jednog primera na drugi slijed primera pod djelovanjem DNA polimeraze. , Je čest nusproizvod PCR-a, a ponekad čak postaje i glavni proizvod.
Osim toga, izbjegavajte homologne sekvence između dva primera, posebno oligonukleotidne fragmente s više od 6 uzastopnih identičnih baza, inače će se dva primera međusobno natjecati za isto mjesto predloška; slično, početnici i ciljna DNA koja se amplificira Ili druge sekvence uzorka DNA ne mogu imati homologne sekvence od više od 6 baza. Inače će se početnici vezati na druga mjesta, smanjujući specifično pojačanje i povećavajući nespecifično pojačanje.
5. Primer 3'kraj uparivanja DNA polimeraze dodaje jedan nukleotid na 3'kraj prajmera. Stoga, zahtjevi za uparivanje 5-6 baza s 3'kraja primera i ciljne DNK moraju biti precizni i strogi kako bi se osiguralo učinkovito PCR pojačanje. .
Je li temeljni dizajn razuman može se provjeriti računalnom pretragom koristeći PCRDESN softver i američki PRIMER softver.
Umjetno sintetizirane oligonukleotide poželjno je pročistiti kromatografijom (kromatografijom) ili PAGE kako bi se uklonile nečistoće kao što su kratki lanci koji nisu sintetizirani do pune duljine. Pročišćeni temeljni premazi pohranjeni u 25% otopini acetonitrila na 4°C mogu spriječiti pojavu mikroorganizama U normalnim okolnostima, neiskorištene primere treba čuvati u hladnjaku na -20°C. Primeri se mogu čuvati u tekućini 6 mjeseci, a mogu se čuvati 1 do 2 godine nakon liofilizacije.