1. Oporavak stanica
Nakon što su kriokonzervirane stanice uklonjene iz tekućeg dušika, odmrznute su uz stalno mućkanje u vodenoj kupelji na 37 stupnjeva. Prenesite otopljene stanice u epruvetu za centrifugiranje, dodajte prethodno zagrijani DMEM potpuni medij na 37 stupnjeva (od čega je fetalni goveđi serum oko 10 posto), nježno ravnomjerno propuhnite, centrifugirajte na 500 g 2 minute i bacite supernatant.
Dodajte potpuni medij DMEM za ispiranje i odbacite supernatant. Dodajte potpunu podlogu DMEM, lagano promiješajte pipetiranjem, napravite suspenziju stanica, inokulirajte je u petrijevu zdjelicu/bočicu i kulturirajte u staničnom inkubatoru koji sadrži 5 posto CO2.
2. Prolaz stanica
Kada gustoća stanica dosegne 80 posto ~ 90 posto (prerani prinos nije dovoljan, prekasne stanice su u lošem stanju, subkultura u omjeru od 1:2 do 1:10 ili više, općenito 1:3 do 1:5 generacija stanica, to jest, od inokulacije stanica. U vrijeme odvajanja i ponovnog uzgoja, kompletan medij je uklonjen i ispran dva puta s 1X PBS.
Dodajte tripsin (napomena: količina otopine za probavu je najbolja da pokrije stanice, a optimalna temperatura za probavu je 37 stupnjeva. Promatrajte stanice pod mikroskopom: promatrajte probavljene stanice pod invertnim mikroskopom, ako je citoplazma povučena, stanice više nisu međusobno povezani. Reznice, što ukazuje da su stanice u ovom trenutku pravilno probavljene), probavite ih i stavite u stanični inkubator na oko 2-3 minuta.
Dodajte odgovarajuću količinu DMEM potpune podloge za zaustavljanje tripsinizacije, prebacite u epruvetu za centrifugu i centrifugirajte na 500 g 2 minute, odbacite supernatant, dodajte DMEM potpunu podlogu za pranje i odbacite supernatant.
Dodajte potpuni medij DMEM, lagano promiješajte pipetiranjem, pipetirajte 10 mikrolitara za brojanje, a zatim nastavite s kulturom u staničnom inkubatoru koji sadrži 5 posto CO2 prema potrebnom volumenu stanica.
3. Krioprezervacija stanica
Kada gustoća stanica dosegne 80-90 posto, uklonite cijeli medij i isperite 2 puta s 1X PBS-om. Dodajte tripsin za probavu i stavite u stanični inkubator na oko 2-3 min. Dodajte DMEM potpunu podlogu za zaustavljanje probave tripsina, prenesite u epruvetu za centrifugu i centrifugirajte na 500 g 2 minute, odbacite supernatant, dodajte DMEM potpunu podlogu za pranje i odbacite supernatant. Dodajte 1 ml otopine za zamrzavanje (90 posto fetalni goveđi serum, 10 posto DMSO. Općenito govoreći, sadržaj seruma može se podesiti između 10 posto i 90 posto. Dodavanje seruma otopini za zamrzavanje može osigurati hranjive tvari za stanice s jedne strane, a može Osigurajte nepropusne zaštitne tvari tijekom krioprezervacije stanica, kao što su saharoza, albumin itd. za bolju zaštitu stanica), stavite je u epruvetu za krioprezervaciju (u epruveti je izopropilni alkohol kako bi se osigurala brzina smanjenja temperature), stavite je odmah Zamrznite u hladnjaku na 4 stupnja na 30 minuta, zatim ga stavite u hladnjak na -20 stupnjeva na 30 minuta, a zatim ga stavite u hladnjak na -80 stupnjeva preko noći.
Sutradan ga stavite u tekući dušik, može se čuvati najmanje dvije godine, a ako ga ne stavite u tekući dušik, može se čuvati tri mjeseca.
Princip krioprezervacije i oporavka stanica je: polagano zamrzavanje i odmrzavanje, što je pogodnije za održavanje vitalnosti stanica. Krioprezervacija stanica bez ikakvog zaštitnog sredstva dovest će do stvaranja intracelularnih kristala leda, koji će uzrokovati endogeno mehaničko oštećenje stanica, uzrokovati promjene u unutarstaničnom okolišu, osmotskom tlaku, pH, elektrolitima itd., a zatim potaknuti staničnu smrt.
4. Pitanja koja zahtijevaju pozornost
(1) Prethodno zagrijavanje otopine kulture: stavite pripremljenu bocu koja sadrži otopinu kulture, PBS i tripsin u vodenu kupelj od 37 stupnjeva da se prethodno zagrije;
(2) Koristite 75-postotni alkohol za brisanje ultra-čistog radnog stola i ruku koje su bile ozračene ultraljubičastim zrakama;
(3) Ispravno postavljanje korištenih instrumenata: osigurajte dovoljno radnog prostora, koji ne samo da je jednostavan za rukovanje, već također smanjuje zagađenje;
(4) Upalite alkoholnu lampu: imajte na umu da plamen ne smije biti premali;
(5) strogi aseptični rad;
(6) Umjerena probava priraslih stanica: na vrijeme probave utječu mnogi čimbenici kao što su vrsta otopine za probavu, vrijeme pripreme i količina dodana u tikvicu kulture. Tijekom procesa probave treba obratiti pozornost na promjene u obliku uzgojenih stanica. Nakon što se citoplazma skupi, ako veza postane labava ili postoje znakovi plutanja u komadima, probavu treba odmah prekinuti;
(7) Sve radnje na pasiranim stanicama trebaju biti što bliže plamenu alkoholne lampe. Najbolje je raditi samo s jednom ćelijom odjednom, koristeći jedan set opreme za svaku ćeliju. izbjegavati unakrsnu infekciju;
(8) Otvor boce pasirane ćelije potrebno je sterilizirati na alkoholnoj lampi svaki put kada se otvori ili zatvori.
