1. Oporavak
●1. Izvadite kriovijalu iz tekućeg dušika, odmah je stavite u vodenu kupelj na 37 stupnjeva i lagano protresite. Nakon što se tekućina otopi (oko 1-1,5 minuta), izvadite je i pošpricajte alkoholom te stavite na ultra-čisti radni stol.
●2. Aspirirajte gornju suspenziju stanica u epruvetu centrifuge od 15 ml napunjenu s 10 ml medija (operite epruvetu za krioprezervaciju medijem da isperete sve stanice koje su se zalijepile za stijenku) i centrifugirajte na 1000 okretaja u minuti 5 minuta.
●3. Izlijte supernatant i dodajte 1 ml medija za suspendiranje stanica. Aspirirano u Petrijevu zdjelicu od 10 cm koja sadrži 10 ml medija kulture i lagano protreseno naprijed-natrag kako bi se stanice u Petrijevoj zdjelici ravnomjerno rasporedile.
●4. Označite vrstu stanice i datum, naziv kultivatora itd. i stavite je u CO2 inkubator za uzgoj. Nakon što se stanice priljube uz stijenku, promijenite medij.
●5. Promijenite medij svaka 3 dana.
2. Prolazak
●1. Pasaža kada pokrivenost stanica u posudi s kulturom dosegne 80 posto -90 posto.
●2. Aspirirajte izvorni medij.
●3. Dodajte odgovarajući tripsin (tek toliko da pokrije stanice) i probavljajte 1-2 minuta.
●4. Nakon što su stanice zaobljene, dodajte jednaki volumen medija koji sadrži serum kako biste prekinuli probavu.
●5. Upotrijebite pipetu za suspendiranje stanica pipetiranjem.
●6. Aspirirajte stanice u epruvetu za centrifugu od 15 ml i centrifugirajte na 1000 okretaja u minuti 5 minuta.
●7. Izlijte supernatant, dodajte 1-2 ml medija i napuhajte stanice.
●8. Prenesite stanice u nekoliko posuda ovisno o vrsti stanice. Općenito, postoji 5 stanica raka i 3 normalne stanice. Nastavite se kultivirati.
3. Krioprezervacija Probavite stanice i centrifugirajte (ibid.). Suspendirajte stanice s pripremljenom otopinom za zamrzavanje i rasporedite ih u sterilizirane krioviale, ostavite da odstoje nekoliko minuta i označite vrstu stanice i datum krioprezervacije. 4 stupnjeva 30 minuta, -20 stupnjeva 30 minuta, -80 stupnjeva preko noći, a zatim stavljeno u tekući dušik radi skladištenja. Priprema otopine za krioprezervaciju: 70 posto potpuni medij plus 20 posto FBS plus 10 posto DMSO. DMSO treba polako dodavati kap po kap, mućkajući dok kapa.
